0 تا 100 کروماتوگرافی + 6 نکته

اگر بخواهیم بگوییم کروماتوگرافی چیست؟ باید گفت کروماتوگرافی به انگلیسی (Chromatography) یا سوانگاری یک روش تحلیلی در علم شیمی است که غالباً برای جداکردن اجزای تشکیل‌دهنده یک مخلوط شیمیایی استفاده می‌شود. در واقع این کار برای آن است که بتوانید به بررسی اجزای تشکیل‌دهنده مخلوط‌ها بپزدارید.

خوب است بدانید در تجزیه و تحلیل شیمیایی، کروماتوگرافی یک روش آزمایشگاهی برای جداسازی مخلوط به اجزای آن است. این مخلوط در یک حلال سیال (گاز یا مایع) به نام فاز متحرک حل می‌شود که از طریق سیستمی (ستون، لوله مویین، صفحه یا ورق) که ماده ای به نام فاز ساکن روی آن ثابت شده است، حل می گردد.

مثال: واکنش زیر را در نظر بگیرید:

A+B -> c

پس از پایان واکنش، ما مخلوطی از واکنش‌دهنده A و B  و محصول C را داریم که در واکنش شرکت نکردند.

در روش Chromatography، ما قادر هستیم هر 3 ماده بالا را در مخلوط از یکدیگر جدا کنیم و ماده C را نیز مورد بررسی قرار دهیم.

مکانیزم کروماتوگرافی

مکانیزم این روش بدین صورت است که مخلوط (به شکل مایع یا گاز) از یک لوله یا شبکه عبور داده می‌شود تا به اجزای تشکیل‌دهنده خود تفکیک گردد و در آخر نیز شاهد خروج هر یک از این اجزا به‌صورت جداگانه باشیم.

نکته 1: سرعت حرکت اجزای تشکیل دهنده مخلوط متفاوت است و بستگی به عناصر دیواره داخلی لوله یا شبکه دارد.

در کروماتوگرافی 2 فاز داریم:

• فاز ثابت که اجزای درون لوله یا شبکه جداسازی را شامل می‌شود.
• فاز متحرک که همان ماده موردنظر است که می‌خواهیم آن را تجزیه و خالص‌سازی کنیم.

نکته 2: فاز ثابت هم می‌تواند مایع باشد و هم جامد. بسته به اینکه در چه حالتی باشد به کروماتوگرافی جذب سطحی و کروماتوگرافی تقسیمی، دسته بندی می گردد.

نکته 3: اساس جداسازی نیز در این روش مختلف است و بر اساس وزن مولکولی و یا میل اتصال به فازِ ثابت می‌باشد.

ازآنجاکه کروماتوگرافی برای جداسازی ترکیبات است پس ترکیب مدنظر در مایعی که فاز متحرک نام دارد حل می‌شود و با ساختار دیگری که فاز ثابت نامیده می‌شود نگهداری می‌گردد. از طرف دیگر با توجه به اینکه سرعت حرکت اجزای مختلف، متفاوت است بنابراین ذرات به راحتی از یکدیگر جدا می‌شوند.

انواع کروماتوگرافی

این روش بر اساس نوع فاز متحرک و فاز ثابت به 4 نوع اصلی تقسیم می‌شود که هر یک از آنها نیز دارای زیر شاخه هایی هستند. اگر فاز ساکن، جامد باشد به آن کروماتوگرافی جذب سطحی و اگر فاز ساکن، مایع باشد بدان کروماتوگرافی تقسیمی می‌گویند.

1- کروماتوگرافی مایع – جامد

•  کروماتوگرافی جذب سطحی
•  کروماتوگرافی لایه نازک# کروماتوگرافی تبادل یونی
•  کروماتوگرافی ژلی

2- کروماتوگرافی گاز – جامد

3- کروماتوگرافی مایع – مایع

• کروماتوگرافی تقسیمی
• کروماتوگرافی کاغذی

4- کروماتوگرافی گاز – مایع

• کروماتوگرافی ستون مویین

جهت راحت‌تر شدن این تقسیم‌بندی‌ها آنها را بر اساس شکل بستر جداسازی، فاز و روش‌های خاص نیز دسته‌بندی کردیم که به توضیح هر یک می‌پردازیم.

👈 خرید بشر آزمایشگاهی

الف: دسته‌بندی روش‌ها بر اساس شکل بستر جداسازی

• کروماتوگرافی ستونی

 همانطور که از نام آن پیدا است جداسازی از طریق یک ستون انجام می‌شود. فاز ثابت درون یک لوله است که به آن column یا ستون می گویند.

در واقع، دارای یک ستون شیشه‌ای است که در پایین آن به یک شیر وصل شده و با سیلیکاژل و حلال آلی پر میشود. سپس جهت حرک کردن مخلوط در ستون، مخلوط را به آهستگی از بالا اضافه و شیر را باز می کنند تا در مرحله آخر، شاهد مخلوط رنگی باشند و بتوانند آنها را جداگانه جمع کنند.

• کروماتوگرافی سطحی

جداسازی توسط یک سطح پهن قابل انجام است و فاز ثابت روی یک سطح می‌باشد و یا خود بصورت یک ورق است.

• کروماتوگرافی کاغذی

تکنیکی است که شامل قرار دادن یک نقطه کوچک یا خطی از محلول نمونه بر روی یک نوار کاغذ کروماتوگرافی می باشد. کاغذ در ظرفی با لایه ای کم‌عمق از حلال قرار می گیرد و مهر و موم می‌شود. همانطور که حلال از کاغذ بالا می رود، با مخلوط نمونه برخورد و شروع به حرکت به سمت کاغذ با حلال می‌کند. این کاغذ از سلولز که یک ماده قطبی می‌باشد ساخته شده است.

• کروماتوگرافی لایه نازک (TLC)

یک تکنیک آزمایشگاهی پرکاربرد است که برای جداسازی مواد بیوشیمیایی مختلف بر اساس جاذبه‌های نسبی آنها به فازهای ثابت و متحرک استفاده می‌شود. شبیه کروماتوگرافی کاغذی است با این تفاوت که به جای استفاده از کاغذ، یک فاز ثابت از یک لایه نازک جاذب مانند سیلیکاژل، آلومینا، یا سلولز روی یک بستر صاف و بی اثر را شامل می‌شود.

ب: دسته بندی روش های کروماتوگرافی بر اساس فاز

• کروماتوگرافی مایع (LC): فاز متحرک، مایع است.
• کروماتوگرافی مایع – جامد: فاز ثابت، جامد است و آنالیت به این فاز جذب می‌شود.
• کروماتوگرافی مایع – مایع: هر دو فاز ثابت و متحرک، مایع هستند. این روش را کروماتوگرافی مایع با فشار بالا (HPLC) می‌نامند. در این نوع، نمونه توسط یک مایع و با فشار زیاد به ستون وارد می‌شود.

اگر فاز ثابت نسبت به متحرک قطبی‌تر باشد کروماتوگرافی مایع فاز نرمال (NPLC) و اگر برعکس باشد کروماتوگرافی مایع فاز معکوس (RPLC) می‌گویند.

• کروماتوگرافی گازی(GC): فاز متحرک، گاز است و غالباً از یک گاز بی‌اثر (نیتروژن، هلیم و آرگون) استفاده می‌شود. به فاز متحرک، گاز حامل می‌گویند.

ج: روش‌های کروماتوگرافی خاص

• کروماتوگرافی تبادل یونی

با تبادل یون، مواد مورد آنالیز را بر اساس بار نسبی که دارند جدا می‌کند. این روش، فاز ثابت بارداری دارد که برای تفکیک ترکیبات باردار مانند آنیون‌ها، کاتیون‌ها، آمینو اسیدها، پپتیدها و پروتئین‌ها می‌باشد.

کروماتوگرافی تبادل یونی به صورت ستونی و صفحه‌ای است.

• کروماتوگرافی اندازه طردی

جداسازی بر اساس اندازه ذرات است.

• کروماتوگرافی فاز معکوس (RPC)

هر کروماتوگرافی مایعی که فاز متحرک ان از فاز ثابت قطبی‌تر باشد.

• کروماتوگرافی واکنش آبگریزی (HIC)

از واکنش آبگریزی بین پروتئین ها و ماتریکس کروماتیک میتوان برای خالص سازی پروتئین‌ها استفاده کرد. این روش برای جداسازی مواد حساس به Ph مناسب است.

• کروماتوگرافی دوبعدی

گاهی جداسازی با یک ستون مقدور نیست. از این رو از 2 ستون استفاده می‌کنند تا با فرایندی موازی عمل جداسازی صورت گیرد.

👈 دستگاه PH متر چیست؟ + انواع Ph متر

آشنایی با اصطلاحات کروماتوگرافی

• آنالیت: همان بخشی است که می‌خواهیم از مخلوط بدست آوریم بعبارتی دیگر ماده ای است که در طول فرایند جدا می‌گردد.
• فاز متحرک: فازی که حرکت آن در یک جهت مشخص است. فاز متحرک می‌تواند مایع باشد (LC و الکتروکروماتوگرافی مویی) یا می‌تواند گاز باشد یا حتی یک سیال فوق بحرانی (کروماتوگرافی مایع – فوق بحرانی، SFC).
• فاز ساکن: ماده تثیبت شده در یک مکان برای کروماتوگرافی است.
• فاز اتصالی: فاز ساکنی که با پیوندهای کووالانسی به داخل دیواره ستون کروماتوگرافی اتصال پیدا کرده است.
• کروماتوگرام: خروجی بصری از کروماتوگراف می‌باشد.
• کروماتوگراف: یک وسیله ازمایشگاهی که امکان جداسازی پیشرفته و تخصصی را فراهم می‌کند.
• Eluent: حلالی است که با خود آنالیت را حمل می‌کند و وارد ستون کروماتوگرافی می‌شود.
• Eluate: ماده‌ای که در بالن جمع آوری می‌شود.
• Elution: فرآیند شستشوی ترکیب توسط ستون کروماتوگرافی که به کمک یک حلال مناسب انجام می‌شود.
• Eluotropic series: لیستی از حلال‌ها که طبق قدرت شویندگی آنها طبقه بندی شدند.
• زمان بازداری: مدت زمانی است که طول می‌کشد تا تحت یک شرایط خاص، یک آنالیتِ مشخص از طریق ستون به سمت آشکارساز عبور کند.
• حلال: ماده‌ای است که می‌تواند ماده دیگری را در خود حل کند که به فاز متحرک مایع در کروماتوگرافی مایع، حلال می‌گویند.
• جسم حل شونده: ترکیبات نمونه در کروماتوگرافی تقسیمی است.
• نمونه: ماده آنالیز شونده در کروماتوگرافی را گویند که از یک ترکیب و یا مخلوطی از ترکیبات تشکیل شده است.
• کروماتوگرافی آنالیزکننده: جهت مشخص شدن وجود و احتمالا غلظت آنالیت ها در یک نمونه به کار می‌رود.

اصول کروماتوگرافی

حال که با اصطلاحات مهم آشنا شدید وقت آن است تا به توضیح اصول کروماتوگرافی بپردازیم.

اصول این روش بدین صورت است که ابتدا باید آنالیت را در بالای بستر سیلیسی قرار دهید. سپس کمی صبر کنید تا به سیلیکا که نقش فاز ساکن را دارد بچسبد. حال، نیروی جاذبه یا فشار، فاز متحرک را که همان حلال است مجبور به حرکت از میان بستر سیلیسی (سیلیکا) می‌کند.

در اینجا مشاهده می‌کنیم که اجزای مختلف آنالیت به طور یکسان به سیلیس نمی‌چسبند و هر یک درجات مختلفی از چسبیدن به سیلیس را نشان می‌دهند. پس قاعدتا سرعت عبور هر جز از فاز ساکن متفاوت است.

این اختلاف در سرعت عبور باعث جداسازی می‌شود که ما این جداسازی را به شکل نوارهای رنگی مختلف می‌بینم و این سبب می‌شود که بتوانیم این اجزا را از یکدیگر جدا کنیم.

نکته4: جزئی که شدیدا جذب آنالیز می‌شود، در مقایسه با سایز اجزا، سرعت حرکت کمتری دارد.

نکته5: مقیاس نمونه برای خالص‌سازی از میلی‌گرم تا گرم است.

مثال عملی

قبل از ادامه، بهتر است آزمایشی را انجام دهیم تا قدرت کروماتوگرافی را بهتر نشان دهد.

1. مقداری برگ را در یک ظرف بریزید و خرد کنید.
2. یک قطره از عصاره برگ را 0.5 سانتیمتر بالاتر از لبه کاغذ، روی کاغذ مخصوص کروماتوگرافی بریزید.
3. کاغذ را در شیشه ای که استون دارد طوری قرار دهید که لبه پایینی کاغذ در این حلال شناور باشد و درب ظرف را نیز ببندید.
4. اجازه دهید نیروی موئینگی، محلول را از کاغذ به سمت بالای آن حرکت دهد.
5. وقتی که حلال به نقطه پایانی رسید، حال باید آن را از شیشه بیرون آورید و مشاهدات خود را بنویسید.
6. در اینجا شاهد آن هستید که اجزای مختلف تشکیل دهنده رنگ برگ از همدیگر جدا می‌شوند.

👈 کالیبراسیون چیست؟ (بهترین زمان+ نام دستگاه ها و…)

چرا ترکیبات مختلف، میل ترکیبی مختلفی در رابطه با فاز متحرک و ساکن دارند؟

پاسخ این سوال قطبیت ترکیب است اما بیایید با یک مثال پاسخ این سوال را بدهیم.

فرض کنید ترکیبی از مولکولهای زیر را داریم:

• یک مولکول بنام A داریم که پروتئین است و قطبی می‌باشد.
• یک مولکول دیگر بنام B داریم که لیپید است.
• ستون کروماتگرافی نیز حاوی سیلیس است که قطبی می‌باشد. از طرفی فاز متحرک ما نیز هگزان است که غیرقطبی می‌باشد.

طبیعتا مولکول A جذب فاز ساکن که قطبی است می‌شود.

مولکول B نیز در فاز متحرک (ناقطبی) حل می‌شود و به سیلیس نمی‌چسبد و با هگزان از محلول خارج می‌شود. با خروج آن، فاز متحرک را به یک فاز قطبی مثل استونیتریل تغییر می‌دهیم تا مولکول A از سیلیس کنده و در حلال قطبی حل می‌شود.

اکنون A با استونیتریل از ستون شسته می‌شود!

ستون کروماتوگرافی چیست؟

یک ابزار در کروماتوگرافی است.

5 روش که در آن از ستون کروماتوگرافی استفاده می‌شود:

1. گازی
2. مایع
3. تبادل یونی
4. اندازه طردی
5. کایرال

ستون کروماتوگرافی با عملکرد بالا

این ستون کروماتوگرافی به نام ستون‌های HPLC شناخته می‌شوند. البته آنها را کروماتوگرافی مایع نیز می‌نامند و فاز متحرک آنها مایع است.

HPLC دارای یک ستون محافظ است که برای افزایش عمر و محافظت از ستون اصلی می‌باشد. فاز ساکن نیز شبیه به ستون اصلی است.

سه نوع ستون‌ مایع داریم که به صورت زیر است:

1. مایع- مایع: فاز ساکن در این ستون، مایع است و به سطح ستون یا مواد پر شده جذب گردیده است. پایداری کمی دارند و بنابراین استفاده از آنها چندان طرفدار ندارد. از طرف دیگر عمل بخش بندی هم بین 2 مایع مختلف در فازهای ساکن و متحرک اتفاق می‌افتد.
2. مایع- جامد: فاز ساکن، جامد است و آنالیت به این فاز جذب می‌شود.
3. تبادل یونی: در اینجا، فاز ساکن نوعی رزین است و عمل بخش بندی نیز بین آنالیت و فاز ساکن اتفاق می‌افتد.

مشخصات ستون های HPLC

در گذشته این ستون‌ها را غالبا از فولاد ضد زنگ می‌ساختند اما امروزه مواد متفاوت‌تری نیز استفاده می‌شود که به صورت زیر است.

• شیشه ضخیم
• پلیمر ها مثل پلی‌اتر اترکتون
• ترکیب شیشه و فولاد ضد زنگ
• ترکیب پلیمر و فولاد ضد زنگ

طول ستون تحلیلی 25-3 سانتیمتر و قطر آن 5-1 میلیمتر است. قطر موادی که در آن پر می‌شود نیز 5-1 میکرومتر می‌باشد.

نکته6: در ستونهای مایع، وقتی که قطر مواد پر کننده کم شود بازدهی بیشتر می‌شود.

ماده پر شده در ستون از چیست؟

این ستونهای HPLC از ذرات متخلخل یا غشایی که جنس آنها پلیمر یا شیشه است ساخته شدند.

از طرفی، لایه ای از سیلیس، رزین سنتزی، آلومینا یا سایر رزین های تبادل یونی، ذرات را احاطه کردند که قطر ذرات 30 تا 40 میکرومتر است.

ذرات متخلخل هم از سیلیس، رزین سنتزی، آلومینا و دیگر رزین‌های تبادل یونی تشکیل شدند که سیلیس بیشترین کاربرد را دارد.